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    技術支持

    PCR反應的核心成份——DNA聚合酶的選擇

    更新時間:2024-03-13   點擊次數:38次

    PCR即聚合酶鏈式反應,對于常年狂奔在實驗室的實驗人來說并不陌生。那么,對于PCR反應的核心成份,DNA聚合酶,你選對了嗎?

    常見的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根據耐熱性來分可分為耐熱酶和常溫酶。耐熱聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等,常溫聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根據保真度來分,高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等,普通聚合酶 Taq 等。

    PCR試劑盒.jpg


    DNA聚合酶的功能

    1)通過核苷酸聚合反應,使DNA鏈沿5’→3’方向延長(DNA聚合酶活性)[1]

    2)催化由3’端水解DNA鏈(3’→ 5’核酸外切酶活性,用于切除錯配的堿基)[1]

    3)催化由5’端水解DNA鏈(5’→ 3’核酸外切酶活性,用于切除引物)[1]

    4)催化由3’端使DNA鏈發生焦磷酸解

    5)催化無機焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷酸三磷酸之間的焦磷酸基的交換

    面對如此之多的選擇,大多數剛進實驗室的新生們默默表示,選擇恐懼癥犯了……那么,解決的方法是,根據實驗目的選擇合適的 DNA 聚合酶。比如:常規的 PCR 擴增和菌液鑒定,長度小于 5kb 的片段,保真度要求不高,使用 Taq 酶擴增即可。選用 Mix 的形式,混樣更加簡單,操作更加便捷。如果混樣泡沫多,想滅掉泡沫的話,推薦大家使用 Green Taq Mix。想要獲得較高的產量,可以選擇 Taq Plus DNA 聚合酶,相對于 Taq 酶擴增性能更強。

    1. 選擇熱啟動酶降低非特異性擴增

    在使用 Taq 酶進行擴增時,有時會出現非特異性擴增,可能的原因可以從模板、引物、體系、程序中一一排查。如模板是否被污染,引物特異性如何,Mg2+濃度偏高等等,其中一個不可忽視的原因是 DNA 聚合酶的種類是否合適。如果排查了其它原因仍舊有非特異性產物,可以選擇熱啟動酶重新實驗,即可有效減少或消除體系中其它產物的積累。常用的熱啟動酶分為兩類:一類是化學法修飾的熱啟動酶,如 Ace Taq ,預變性 95℃5 - 10 min 即可釋放酶活;一類是抗體法修飾的熱啟動酶,如 Champagne Taq ,預變性 95℃30s 即可釋放酶活。使用時注意預變性時間,方能獲得滿意的擴增效果。

    2. 選擇 Lamp 擴增長片段

    大于 5Kb 的長片段又該如何擴增呢?如果實驗對保真度的需求不高,那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍,可擴增超過 20Kb 的基因組、cDNA 片段,對于低拷貝、低純度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。

    3. 選擇高保真酶快速高效擴增

    如果實驗對保真度要求較高,在選擇 DNA 聚合酶的時候就需要使用高保真酶,如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。前三者都屬于第一代高保真酶,已在市場中廣泛使用。諾唯贊科研團隊的大力改造生產的 Phanta 系列的高保真酶,保真度達到了 Taq 酶的 50 倍,擴增性能、擴增長度、產量、模板適應性都顯著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍,Pfu 的 6 倍,對于質粒等簡單模板有效擴增長度可達 40kb,cDNA 有效擴增長度可達 10kb,基因組有效擴增長度可達 20kb,適合于各種 GC 含量的擴增,可用于多種樣本的直接 PCR 如植物葉片、全血等。且擴增僅需 30s/kb,甚至于 2kb/s。如此卓zhuo越,愛不釋手了吧?

    4. 選擇直接擴增試劑盒對粗品擴增

    xxx生產的各種直擴試劑盒,直接對粗品進行擴增,大大減少了實驗的工作周期。如小鼠基因型鑒定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit,全血擴增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。

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