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    技術支持

    PCR失敗因素與解決方法

    更新時間:2024-03-05   點擊次數:57次

    一 、模板質量問題:

    1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低??梢耘軅€電泳看看提取的DNA,PCR陽性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問題,可以增加模板量試試,但不一定行得通。

    2)模板里面殘留某種試劑成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是這種情況,可以用試劑盒把模板再純化一下,或將模板做個梯度稀釋以確定最佳的模板量。

    3) 為什么跑電泳會出現拖帶呢?

    1. 有可能的因為你的電壓調的太高了。電泳跟很多因素有關,其中就有一個是電壓,在適當的電壓范圍內增加是可以加快遷移速率,但是要是超到一個臨界值反而有害。你可以適當的調低點看看。

    2.有時候發現上樣量太多的話會有拖帶。你看能否回收之后 ,按1:50 或1:100 等稀釋后,再當成模板擴一次怎么樣。

    二 、引物問題

    1)樣品自身的基因型差異導致擴增失敗。也就是說你的引物與某些基因型的樣品結合的好,而和另一些基因型結合不好??梢該Q一對更保守的引物試試。祝順利!

    2)普通PCR所用的一對引物中有一個引物加多了,為正常的三倍只要引物特異性比較好,那么不會產生大的影響。如果恰巧是加多的這條引物不是很特異的話,也許會擴出來非特異帶。

    在制備單鏈探針時候就采取這樣的不對稱pcr,沒關系的三Taq酶處于失活狀態。因為活性降低了能出現二聚體。

    三、Taq酶處于失活狀態。因為活性降低了能出現二聚體。

    四、模板濃度過低。

    五、退火溫度過高。有可能,可以做個梯度PCR試一下。

    六、循環次數過少或延伸時間過短以致目的基因擴增量不夠。這個可能性不大。


    七、dNTP濃度低時PCR產率及特異性均增高,適合于用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA(dNTP消耗一半),所以,你不小心多加了4倍的量,會很影響PCR結果,即Taq酶活力要降低20~30%,即底物抑制。

    八、PCR產物電泳

    1.電泳圖不清晰,可能電泳緩沖液和制膠緩沖液濃度不準或者臟了吧。換新的電泳緩沖液和制膠緩沖液試試。

    marker都出問題說明是你的膠的問題,或者電泳操作的問題。

    2. PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。

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